17065

17065

استخراج مايع-مايع پروتئين با وزن مولكولي پايين با استفاده از سامانه ميسل معكوس

كارشناسي ارشد

بيوتكنولوژي

ارديبهشت ماه 1395

دكتر پريسا حجازي

دكتر بهرخ فرهمند

شيمي

چكيده استخراج مايع- مايع يكي از روش¬هاي جداسازي است كه زيرمجموعه¬ي آن استخراج توسط ميسل معكوس است. سيستم ميسل معكوس، به جهت اينكه روش جداسازي سريع و ساده و با بازدهي بالا مي‌باشد، مورد توجه قرار گرفته است. ﺑﺎ ﭘﻴﺸﺮﻓﺖ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﭘﺮوﺗﺌﻴﻦ¬ﻫﺎي ﻧﻮﺗﺮﻛﻴﺐ ﺗﻮﺳﻂ ﻣﻴﺰﺑﺎن ﻣﻴﻜﺮوﺑﻲ، ﺟﺪاﺳﺎزي و ﺧﺎﻟﺺ‌ﺳﺎزي اﻳﻦ محصوﻻت از ﻣﺤﻴﻂ ﺗﺨﻤﻴﺮي و ﻻﺷﻪ ﺳﻠﻮﻟﻲ از ﭼﺎﻟﺶﻫﺎي ﭘﻴﺶ روي ﺗﻮﻟﻴﺪ اﻳـﻦ ﭘـﺮوﺗﺌﻴﻦﻫـﺎ ﻣـﻲ ﺑﺎﺷـﺪ. براي اين منظور از پروتئين انسولين به عنوان مدل پروتئيني با وزن مولكولي كم، استفاده شد. براي انجام فرايند استخراج از سيستم CTAB/ ايزواكتان/ ان هگزانول/ ان بوتانول استفاده شد. اثر فاكتورهاي موثر بر فرايند پيشرو و پسرو با استفاده از طراحي آزمايش يك فاكتور در يك زمان بررسي شد. ميزان بهينه استخراج در شرايط غلظت ماده فعال سطحي mM30، غلظت نمك NaCl mM50، درصد حجمي هگزانول به عنوان كوماده فعال سطحي %v/v 10، درصد حجمي بوتانل به عنوان كمك حلال %v/v 10 و غلظت نمك M0.6 KCl در pH ثابت 7 براي هر دو مرحله و مدت زمان تماس پيشرو 90 ثانيه و زمان پسرو 15 دقيقه، معادل 97% در فرايند پيشرو و 76% در فرايند پسرو به دست آمد. دو روش به منظور بررسي انتخاب‌پذيري اين فرايند بكار برده شد. در روش اول، انسولين در محيط تخمير و در حضور ساير پروتئين‌هاي باكتري وارد شد كه انتخاب‌پذيري استخراج انسولين در شرايط بهينه به دست آمده از طراحي يك فاكتور در يك زمان نسبت به ساير پروتئين‌هاي باكتري با استفاده از روش الكتروفورز بررسي و نتايج قابل قبولي حاصل شد. همچنين به منظور مقايسه‌ي انتخاب¬پذيري با مولكول مشابه از نظر نقطه ايزوالكتريك ولي درشت¬تر از انسولين، آنزيم آميلاز در نظر گرفته شد. ابتدا طراحي آزمايش فاكتوريل براي تعيين نقطه بهينه استخراج انسولين انجام شد. سپس در شرايط بهينه حاصل (غلظت ماده فعال سطحي mM40، درصد حجمي بوتانل به عنوان كمك حلال %v/v 10 و غلظت نمك KCl M0.8 در pH ثابت 7 براي هر دو مرحله و مدت زمان تماس پيشرو 5 دقيقه و زمان پسرو 20 دقيقه)، انتخاب پذيري در شرايط غلظت مساوي از هر دو مولكول بررسي شد. در اين شرايط، بازده انسولين در فرايند پيشرو و پسرو به ترتيب 65 و 55% به دست آمد و غلظت آنزيم آميلاز در فاز پسرو به صفر رسيد كه بيانگر جداسازي كامل اين دو بيومولكول از يكديگر است. واژه‌هاي كليدي: استخراج مايع- مايع، ميسل معكوس، CTAB، انسولين، انتخاب پذيري، آنزيم آميلاز

1396/01/20

1/1/1900 12:00:00 AM

Abstract: Reverse micelle extraction (RME) is one of the liquid-liquid extraction methods. RME is a fast an​d simple method with high efficiency. With the progress in production of recombinant proteins by microbial hosts, separation an​d purification of these productions from fermentation media an​d cell debris has become the main challenge of production of the proteins. For this purpose, insulin was taken as a low molecular weight protein model an​d CTAB/ Isooctane/n-Hexanol/n-Butanol was used for RME process. Extraction using reverse micelle methods contains two main parts of forward an​d backward steps which the protein transfer to an organic phase in forward extraction an​d then to a new aqueous phase during backward extraction step. Effective factor was determined using one factor at a time design an​d the optimum conditions was obtain as: 30mM of surfactant concentration, 50mM of NaCl conc., 10% v/v of each Hexanol as cosurfactant an​d Butanol as co-solvent, an​d KCl conc. of 0.6M at constant pH 7 for both steps an​d contact time of 90s an​d 15min for forward an​d backward steps, respectively. The extraction yields of these conditions are 97 an​d 76% for forward an​d backward processes, respectively. Two methods were used to eva​luate the selectivity of this process. First, insulin was added to fermentation medium in the presence of other bacterial proteins. Insulin selectivity extraction was investigated at optimum condition obtained from one factor at a time design an​d insulin selectivity extraction related to other proteins was validated using electrophoresis gel. Then, in order to compare the selectivity extraction of insulin to a molecule with similar isoelectric point value an​d different molecular size, α-amylase was used. Ful factorial design was firstly done for determining of optimum conditions of insulin extraction an​d then the selectivity was investigated at the obtained optimum condition (surfactant concentration of 40mM, 10% v/v n-butanol as solvent an​d and KCl conc. of 0.8M at constant pH 7 for both steps an​d contact time of 5min an​d 20min) in the presence of equal two molecules concentartions. At this condition, insulin extraction yield was 65 an​d 55% in forward an​d backward extractions, respectively an​d amylase concentration in backward step became zero that represents a complete separation of the two biomolecules. Keywords: liquid-liquid extraction, reverse micelles, CTAB, Insulin, selectivity, amylase