17564

17564

بررسي تفكيك تمايلي DNA پلاسميدي در سيستم‌هاي دوفازي آبي

دكتري تخصصي

مهندسي شيمي

ارديبهشت 1396

دكتر محمدرضا دهقاني - دكتر بهرام گليايي

شيمي، نفت و گاز

هدف از اين پژوهش استخراج داده‌هاي تعادلي ترموديناميكي و ارائه يك سيستم جداسازي نوين بر پايه سيستم‌هاي دو فازي آبي رايج و افزودن ليگاند تمايلي به منظور افزايش بهره‌وري جداسازي DNA پلاسميدي (pDNA) به عنوان يكي از كاربردي‌ترين زيست‌مولكول‌هاي صنعتي است. بدين منظور در مرحله نخست از پژوهش، پس از انتخاب سيستم‌ دو فازي و ليگاند تمايلي مناسب تفكيك‌پذيري ليگاند و مولكول DNA پلاسميدي، به طور مجزا در سيستم‌هاي حاوي پلي‌اتيلن‌گليكول (PEG) و نمك سولفات‌سديم (Na2SO4) مورد بررسي قرار گرفت و تأثير پارامترهايي نظير pH (6، 5/4 و 3) ، دما (°C 30 و 20)، وزن مولكولي پليمر (Da 4000، 1500، 1000 و 600)، غلظت ليزيت ((w/w) 60%، 45 و 30) و همچنين افزودن نمك‌هاي ثانويه (KH2PO4، KCl و MgSO4) بر مقادير بازده بازيابي و ضريب توزيع به عنوان متغيرهاي وابسته ارزيابي شد. در ادامه تلاش شد تا با بهره‌گيري از ليگاند تمايلي اليگونوكلئوتيدي كه به واسطه طراحي منحصر به فرد آن به صورت انحصاري به توالي مشخصي از DNA پلاسميدي متصل مي‌گرد بازده بازيابي DNA پلاسميدي به عنوان زيست‌مولكول هدف و همچنين ميزان خلوص آن در سيستم افزايش داده شود. به همين منظور در شرايط عملياتي مشابه نحوه توزيع كمپلكس DNA پلاسميدي- ليگاند مورد ارزيابي قرار گرفت تا نقش ليگاند در تغيير رفتارهاي تفكيك‌پذيري DNA پلاسميدي مورد ارزيابي قرار گيرد. نتايج حاصله حاكي از آن بود كه توزيع ليگاند تنها در سيستم به گونه‌اي است كه در شرايط عملياتي معين 88/99 % ليگاند از فاز فوقاني غني از پليمر قابل بازيابي مي‌باشد. در خصوص DNA پلاسيمدي اوضاع به كلي متفاوت بود، به نحوي كه در شرايط عملياتي مشابه و در حضور (w/w) 60 % از محلول ليز قليايي تجمع مولكول‌هاي pDNA در فاز فوقاني غني از PEG برابر 94/4 % و در فاز تحتاني غني از نمك معادل با 42/35 % اندازه‌گيري شد. پس از افزودن ليگاند تمايلي به DNA پلاسميدي، نتايج نشان داد، بدون آنكه تغيير چشمگيري در تفكيك‌پذيري مولكول‌هاي پروتئين و RNA مشاهده شود، 33/67 درصد از كمپلكس‌ حاصل در فاز فوقاني تجمع مي‌يابد، كه اين امر شرايط را براي تخليص نسبي مولكول‌هاي pDNA مهيا مي‌سازد. در انتها نيز با استفاده از داده‌هاي تعادلي ترموديناميكي بدست آمده، نحوه توزيع ليگاند تمايلي در سيستم حاوي نمك سولفات‌سديم و پلي‌اتيلن‌گليكول با وزن مولكولي Da 4000 با استفاده از مدل UNIFAC-FV مدل‌سازي شد و پارامترهاي برهمكنش دو تايي ميان زيست‌مولكول و ساير گروه‌هاي موجود در سيستم براي اولين بار استخراج گرديد. شايان ذكر است كه مدل مذكور به واسطه لحاظ نمودن سهم هريك از گروه‌هاي موجود در سيستم در محاسبات ضريب اكتيويته، در مقايسه با ساير معادلات نظير NRTL (Nonrandom Two-Liquid) و UNIQUAC از توانايي بيشتري در پيش‌بيني رفتارهاي تفكيك‌پذيري در سيستم‌هاي دوفازي آبي برخوردار است. نتايج مدل‌سازي بيانگر آن بود كه مدل ارائه شده از توانمندي قابل قبولي در پيش‌بيني رفتارهاي تفكيك‌پذيري ليگاند تمايلي برخوردار است. واژه‌هاي كليدي: سيستم‌هاي دو فازي آبي، جداسازي زيستي، تفكيك تمايلي، DNA پلاسميدي، UNIFAC-FV

1396/04/14

7/3/2025 12:00:00 AM

Aqueous two-phase systems (ATPSs) as a liquid-liquid extraction method have received lots of attention in last few years. Having several advantages such as integration of different extraction steps, simplicity of scale-up and low operational cost have made them applicable in extraction and purification of the biomolecules. Moreover, the high water content in both phases provides a proper environment for recovery of a wide variety of biomolecules such as enzymes, proteins, nucleic acids and virus-like particles. However, the main drawback of these systems is their low recovery yield in comparison to common industrial purification methods such as chromatography. In order, to overcome this inconvenience, affinity partitioning was proposed as an alternative technique to improve the purification factor. In this method an affinity ligand with high distribution factor binds to the target molecule and directs it toward a specified phase with minimum contaminants. In this work, the partitioning of the affinity ligand and the plasmid DNA (pDNA) were first studied separately in aqueous two-phase systems containing polyethylene glycol and sodium sulfate. The effect of some of the operational parameters such as pH (3. 4.5, and 6), polymer molecular weight (600, 1000, 1500, and 4000), lysate load, (30, 45, and 60 (w/w)%) and the addition of second salts (KH2PO4, KCl, and MgSO4) to the systems on the partitioning behavior of the biomolecules were also investigated. The results demonstrated that at certain conditions, 99.88% of affinity ligands were recovered in the top phase. At the similar conditions and a lysate load of 60%, the recoveries of pDNA from the top and the bottom phase were 4.94 % and 35.42 % respectively. Furthermore, the protein recovery yield was 8.07 % in the top PEG-rich phase and it was 39.95 % in the bottom salt-rich phase, regarding the fact that the protein content is known as the main contaminant in the system. Partitioning of RNA molecules in the system was also visualized by gel electrophorese analysis. The results showed that the RNA molecules highly preferred the bottom phase to accumulate as the same of pDNA molecules. In continue, the pDNA and the affinity ligand were added to the system simultaneously, and the partitioning of the pDNA-ligand complex was measured and it was observed that 67.33 % of the complex was recovered in the top phase without any significant change in the RNA partitioning. Finally, the partitioning of the affinity ligand was correlated using a model based on the UNIFAC-FV group contribution due to its higher ability in prediction of phase behavior in aqueous two-phase systems in comparison with UNIQUAC and NRTL (Non-Randome Two Liquids) models. The results showed that the model correlated the partitioning of the oligonucleotide with an acceptable accuracy. Keywords: Aqueous Two-Phase Systems, Bioseparation, Plasmid DNA, Affinity Partitioning, UNIFAC-FV