23121

جداسازي انسولين با استفاده از مولكول‌نگاري سطحي بر نانوذرات مغناطيسي

دكتري

مهندسي شيمي

1391

1399/6/30

دكتر پريسا حجازي

مهندسي شيمي، نفت و گاز

پلي‌پپتيد انسولين يكي از فراورده‌هاي زيستي مهم است كه بايد با خلوص قابل قبول به بيماران ديابتي عرضه شود. مولكول‌نگاري سطحي پليمرها به‌عنوان روشي نسبتا ساده و گزينش‌پذير براي شناسايي و جداسازي درشت‌مولكول‌هاي زيستي استفاده مي‌شود. در اين تحقيق، جداسازي انسولين به كمك پليمرهاي مولكول‌نگاري شده برنانوذرات مغناطيسي اصلاح سطح شده مورد بررسي قرار گرفت. از متاكريليك‌اسيد و اكريل‌آميد، متيلن‌بيس‌اكريل‌آميد، و آمونيوم پرسولفات به ترتيب به عنوان مونومرهاي عاملي، اتصال‌دهنده عرضي و آغازگر پليمريزاسيون استفاده و مولكول‌نگاري در محيط آبي انجام شد. در گام نخست، تاثير 5 متغير در دو مرحله پليمريزاسيون و جدايش انسولين از پليمر با شستشو به¬طور همزمان به روش طراحي يك فاكتور در هر زمان بر سنجش مولكول¬نگاري مورد مطالعه قرار گرفت. در مرحله پليمريزاسيون، تاثير pH حلال آبي، غلظت اتصال‌دهنده عرضي و تاثير توجه به ساختمان انسولين در تعيين نسبت مونومرهاي عاملي و در مرحله جدايش انسولين از پليمر تشكيل‌شده (و دستيابي به پليمر مولكول‌نگاري شده داراي مكان‌هاي پيوندي ويژه)، تاثير نوع حلال و زمان انجام فرايند شستشو بررسي شد. روش‌هاي مختلف كمي و كيفي براي اطمينان از تشكيل‌ پليمر سطحي، مقدار انسولين مولكول¬نگاري¬شده، بازده شستشوي انسولين از پليمر و سنجش عملكرد سامانه مورد استفاده قرار گرفت. در گام بعدي، بر مبناي نتايج به دست آمده و با ثابت نگه داشتن نسبت مونومرها، تاثير غلظت مونومرها (شامل مونومرهاي عاملي و اتصال‌دهنده عرضي) در 7 سطح و كنترل نوسانات دماي پليمريزاسيون در 3 سطح با درنظر گرفتن 6 پاسخ كمي و كيفي به روش طرح عاملي كامل مطالعه و نقطه بهينه چند پاسخي به روش تابع مطلوبيت مشخص شد. شرايط بهينه مولكول¬نگاري پليمرها با نسبت مولي 1:40:200:10 براي متيلن‌بيس‌اكريل‌آميد: اكريل‌آميد: متاكريليك‌اسيد: انسولين (به دست آمده از مطالعه ساختمان انسولين) در بافر فسفات با غلظت 100 ميلي‌مولار و 6 pH در دماي كنترل‌شده °C 23 به دست آمد. شرايط شستشوي پليمرها محلول 10 درصد حجمي استيك‌اسيد در متانول براي 72 ساعت تعيين شد و فاكتور نگارش برابر با 2/5 به دست آمد. روش‌هاي تعيين درصد وزني نانوذرات، قدرت مغناطش و سطح ويژه و ميكروسكوپ الكتروني روبشي گسيل ميداني، تشكيل لايه پليمري نازك (حدود 7 درصد وزني) روي سطح نانوذرات با قدرت مغناطيسي مناسب (emu.g-1 20/1) با سطح ويژه m2.g-63/16 و ميانگين اندازه كمتر از 50 نانومتر را تاييد كرد. بررسي‌ها نشان داد كه بازجذب انسولين در نقطه بهينه از مدل‌هاي سينتيكي شبه درجه يك و دو پيروي مي‌كند و بازجذب در كمتر از 12 ساعت كامل مي‌شود. اين فرايند به¬صورت خودبخودي و با تمايل بالا و همچنين با تطابق خوبي با مدل ايزوترم جذب لانگموير و 1/5=K انجام مي‌شود. نتايج نشان داد جايگاه‌‌هاي پيوندي ويژه روي سطح يا نزديك به سطح قرار دارند و براي جداسازي انسولين در محيط با غلظت‌هاي كم و زياد كاربردي هستند. هم‌چنين اين سامانه قابليت استفاده براي 5 مرحله متوالي فرايند بدون كاهش قابل ملاحظه در توان جداسازي را دارد. در تعيين قابليت گزينش‌پذيري سامانه از جذب رقابتي انسولين نسبت به آلفا-آميلاز استفاده شد و فاكتور نگارش به ترتيب برابر با 0/83 و 2/5 براي آلفا-آميلاز و انسولين به دست آمد. اين آنزيم همه اسيدهاي آمينه انسولين را در سطح خود داراست ولي از نظر اندازه متفاوت است. نتايج حاصل، لزوم توجه به ساختمان انسولين در انتخاب نوع و نسبت اجزاي مولكول‌نگاري را نشان داد.

1399/11/12

Insulin separation by molecular imprinting on the surface of the magnetic nanoparticles

9/21/2021 12:00:00 AM

Insulin is an important biomolecule which should be purely delivered to diabetic patients. Surface molecular imprinting is a selective method that can be used in the recognition and separation of biological macromolecules. In this research, molecular imprinting on the surface of modified magnetic nanoparticles was studied for the separation of insulin. Methacrylic acid and acrylamide, methylene bisacrylamide, ammonium persulfate were used as the functional monomers, cross-linker, and polymerization initiator, respectively. Different quantitative and qualitative analyses methods were used for determination of the amounts of the monomers participate in the surface polymer formation, amounts of the imprinted insulin, and the system performance. At the polymerization step, the effects of different factors containing the amount of cross-linker as the main component responsible for the formation of the surface polymer, biomolecule structure on the ratios of the functional monomers that should bind with it, and synthesis media specifications were explored using one factor at a time method. In the process of the separation of insulin from the polymer (to obtain the system with specific binding sites) the effects of the solution type and elution time as the main influencing factors were studied by one factor at a time method. Next, the effects of the total monomers' content (7 levels) and polymerization temperature control (3 levels) were studied by full factorial design considering 6 responses, simultaneously, and optimization was performed by the desirability function. Finally, the optimal conditions for the preparation of polymers were determined as molar ratio of 1: 40: 200: 10 for insulin: methacrylic acid: acrylic amide: methylene bis acrylamide (obtained from insulin structure) in phosphate buffer with a concentration of 100 mM and pH=6 at 23°C (with temperature control), eluted with the solution of acetic acid in methanol (10% v/v) for 72 hours. The imprinting factor was found to be 2.5. Field emission scanning electron microscopy and specific surface analysis demonstrated the formation of the spherical nanoparticles with a size of about 50 nm with a specific surface of 63.6 m2.g-1.Thermo-gravimetric analysis and vibrating sample magnetometer analyses confirmed the thin (about 7% of total weight) and uniform core-shell structure of polymers with high saturation magnetization (20.1  emu g−1). Studies showed that insulin rebinding follows pseudo-first- and pseudo-second-order kinetic models and rebinding is complete in less than 12 hours. The process is done spontaneously with high affinity. The imprinted cavities located on or close to its surface, and are practical for the separation of low and high abundance of insulin. This system could be reused for at least five times cyclically. The system's acceptable selectivity for insulin absorption in competition with amylase (imprinting factor was 0.83 and 2.5 for amylase and insulin, respectively) also demonstrated the importance of considering the template structure in the selection of the types and ratios of the monomers.

انسولين , جداسازي , مولكول‌نگاري سطحي پليمرها , نانوذرات مغناطيسي اكسيد آهن

Iron oxide magnetic nanoparticles , Insulin , Separation , Surface molecular imprinting