16735

16735

تثبيت يك آنزيم هيدروليزكننده بر نانوذرات مغناطيسي

دكتري

بيوتكنولوژي

ارديبهشت 1395

دكتر پريسا حجازي

مهندسي شيمي

تثبيت آنزيم به عنوان راهي براي غلبه بر چالش‌هاي موجود در استفاده از آنزيم‌ها در مقياس صنعتي مورد توجه محققان قرار گرفته است. علي‌‌رغم مطالعات بسيار انجام شده در حوزه تثبيت آنزيم، همچنان خلاء‌هاي تحقيقاتي زيادي در راستاي افزايش عملكرد آنزيم تثبيت شده و امكان استفاده در مقياس صنعتي وجود دارد. در اين تحقيق تثبيت كووالانسي آنزيم آلفا-آميلاز بر روي نانوذرات مغناطيسي اصلاح شده مورد بررسي قرار گرفته است. دو دسته از نانوذرات با و بدون پوشش سيليكايي، با استفاده از گروه¬هاي عاملي آميني اصلاح سطح شدند و نانوذرات اصلاح شده با غلظت¬هاي مختلف گلوتارآلدهيد فعالسازي شدند. از آنجايي¬كه حامل‌هاي فعال شده با گلوتارآلدهيد در قدرت‌هاي يوني¬ مختلف به روش‌هاي مختلف جذب فيزيكي (جذب آبگريز و تعويض يون) و شيميايي (كووالانسي) مي‌توانند وارد فرآيند تثبيت آنزيم شوند، لذا ميزان تثبيت آميلاز و فعاليت آنزيم تثبيت شده در سه قدرت يوني پايين، متوسط و بالاي محلول مورد بررسي قرار گرفت. همچنين نوع پيوند تشكيل¬شده بين آنزيم و حامل با استفاده از تعيين ميزان رهايش آنزيم در محيط‌هاي مختلف و همچنين بررسي سينتيك جذب و تست FTIR مشخص گرديد. براساس نتايج بدست آمده در اكثر موارد، مكانيسم اوليه غالب در تثبيت آميلاز بر روي نانوذرات مغناطيسي فعال شده با گلوتارآلدهيد از نوع جذب فيزيكي است كه پس از آن پيوند كووالانسي بين آنزيم و حامل تشكيل مي‌شود. ميزان تثبيت آميلاز و فعاليت آن در مورد نانوذرات مغناطيسي با پوشش اوليه سيليسي اندكي بيشتر از نانوذرات بدون اين پوشش است و در مورد هر دو نوع نانوذره، فعالسازي با مقدار كم گلوتارآلدهيد (5/0%) و قدرت يوني پايين ( mM5 بافر فسفات سيترات) نتايج بهتري نشان مي‌دهد. پس از آن اثر عوامل موثر بر تثبيت از جمله، غلظت اوليه آنزيم، غلظت گلوتارآلدهيد، زمان تثبيت، pH و قدرت يوني محيط تثبيت با استفاده از روش CCD مورد بررسي قرار گرفت. همچنين دو پاسخ مقدار آنزيم تثبيت شده و فعاليت آن بطور همزمان با استفاده از تابع مطلوبيت مورد مطالعه واقع شد. مقدار بهينه بارگذاري و فعاليت آنزيم تثبيت شده به ترتيب mg/gMNP 41/556 و U/mg 83/24 در غلظت اوليه‌ي آنزيم برابر با ppm 86/999، مقدار pH 6/4، غلظت گلوتارآلدهيد 59/0%، قدرت يوني mM 99/99 و زمان h 4 ساعت بدست آمد. مطالعه پارامترهاي سينتيكي و استحكام آنزيم در شرايط آزمايشگاهي و شرايط نزديك به شرايط عملياتي صنعتي مورد بررسي قرار گرفت. نتايج نشان داد كه عملكرد آنزيم تثبيت شده نسبت به آنزيم آزاد به‌ طور قابل توجهي در دو حالت صنعتي و آزمايشگاهي افزايش يافته است. ماندگاري و استفاده مجدد بيوكاتاليست تثبيت شده به ترتيب حدود 50 و 40 درصد فعاليت اوليه آنزيم پس از 12 روز و 6 سيكل در شرايط غلظت پايين بدست آمد. در بررسي شرايط نزديك به صنعتي نيز آنزيم تثبيت شده پس از 6 سيكل تنها 40 درصد افت عملكرد نشان داد.

1395/12/03

1/1/1900 12:00:00 AM

Enzyme immobilization as a way to overcome challenges of using enzymes in industrial scale has been considered. In this research, the effects of coating an​d that of activation level on surface of magnetic ferric oxide nanoparticles (MNPs) on immobilization of amylase were investigated. Two MNPs with two different coating conditions -uncoated an​d silica coated- were subject to surface treatment using the amine groups an​d then activated with different concentrations of glutaraldehyde (GA). The GA activated carriers can take part in enzyme immobilization process through various physical, e.g. hydrophobic adsorption an​d ion exchange an​d chemical, e.g. covalent, adsorption methods. The ionic strength of the medium would have an impact on determination of the predominant method; whether it is dominated with a physical o​r a chemical mechanism. Therefore, the immobilization level an​d activity of the immobilized enzyme were studied for three low, moderate, an​d high ionic strengths of buffer solution. Furthermore, the type of the bond developed between enzyme an​d carrier was identified using amount of the immobilized enzyme release under different environments as well as adsorption kinetic studies an​d FTIR analysis. The results suggest that for most cases, the mechanisms for amylase immobilization on MNPs activated with GA occur in the following order: First physical adsorption occurs followed by forming covalent bond between enzyme an​d carrier. The effects of different operational conditions of α-amylase covalent immobilization on magnetic nanoparticles (MNPs), such as initial enzyme concentration, glutaraldehyde (GA) concentration, pH, ionic strength, were investigated using central composite design (CCD). Moreover, the two responses of biocatalyst activity an​d amount of immobilized enzyme were simultaneously studied by using Derringer’s desirability function. The optimum amount an​d activity of immobilized enzyme were determined as 24.83% an​d 556.41 mg/gMNP at 999.86 ppm initial enzyme concentration, solution pH of 4.6, 0.59% GA concentration, 99.99 mM ionic strength an​d 4 h process time. Kinetic parameters an​d stability of free an​d immobilized enzyme were studied in laboratory an​d industrial operational conditions. The results showed the significant enhancement in the performance of the immobilized enzyme with respect to the free enzyme in two mentioned conditions. The storage stability an​d reusability of immobilized biocatalyst were obtained about 50 an​d 40% of the initial activity after 12 days an​d 6 cycle uses, respectively in low concentration of substrate. Moreover, Immobilized enzyme showed only 40 % performance decrease in the case of industrial conditions.