3694

3694

افزايش كارايي آنزيم تايروزيناز از طريق تثبيت آن بر روي فاز جامد

كارشناسي ارشد

ﻣﻬﻨﺪﺳﻲ ﺷﻴﻤﻲ-بيوتكنولوژي

ارديبهشت 1384

1384

دكتر سعيد مقصودي , دكتر كمال الدين حق بين

دكتر فرشته نعيم پور

09

در اين پايان نامه ،مطالعه اي كامل بر روي كارايي آنزيم تايروزيناز پس از تثبيت در ژل پلي اكريل آميد در محيط هاي بافر فسفات و مخلوط بافر فسفات با حلالهاي آلي (استونيتريل ،ايزوپروپانل ،متانول و تتراهيدروفوران)صورت گرفته است .بهيمن منظور ابتدا تخليص آنزيم تايروزيناز از قارچ خوراكي كه منبعي ارزان و قابل دسترس مي باشد صورت گرفت .در اين راستا ،اثر بافرهاي مختلف بر روي ميزان استخراج آنزيم از قارچ خوراكي و نيز اثر حلالهاي آلي در حذف تركيبات مزاحم از عصاره پروتئيني بررسي شد .همچنين ميزان خلوص نسبي رسوب حاصل از محلول عصاره پروتئيني بوسيله درصدهاي مختلف اشباع نمك سولفات آمونيوم مورد بررسي قرار گرفت .در اين تحقيق جهت بدست آوردن خلوص بالاتري از آنزيم ،از ستون تعويض آنيوني نيز استفاده شد و در نهايت از آنزيم تخليص شده ژل الكتروفورز گذاشته و فعاليت كرزولار و كتكولاز آنزيم نيز سنجيده شد .پس از بدست آوردن خلوص نسبي آنزيم در رسوب حاصل از غلظت 55/. اشباع نمك سولفات آمونيوم ،مرحله تثبيت آنزيم در ژل انجام شد .ابتدا جهت بررسي شرايط تثبيت ،آليومين سرم گاوي (BSA ) در ژل آكريل آميد تثبيت شد و درمخلوط حلالهاي ذكرشده و بافر فسفات با درصدهاي 0 ،25 ،50 ،75 ،100 ، نگهداري شد و پس از 20 و 144 ساعت ،ميزان خروج پروتئين از ژل بوسيله دستگاه اسپكتروفتومتر و nm 280 سنجيده شد .استونيتريل و ايزوپروپانل با درصدهاي مختلف جهت سنجش كارايي ژل در حفظ آنزيم انتخاب شدند .آنزيم تايروزيناز در ژل محبوس شد و در همان مخلوط حلالها نگهداري شد و در زمانهاي 24 و 144 ساعت ميزان و خروج آنزيم nm 280 اندازه گيري گرديد .درصدهاي مختلف ايتونيتريل و ايزوپروپانل به عنوان محيطهاي نگهداري ژل و سنجش فعاليت كرزولار آنزيم تثبيت شده با استفاده از سويستراي متيل فنل مورد استفاده قرار گرفتند .سنجش فعاليت كرزولار آنزيم محبوس شده در ژل در زمانهاي 0،28،96،144، ساعت در مورد ژلهايي كه در مخلوط حلال نگهداري شده بودند ،انجام شد .همچنين سنجش فعاليت كرزولار آنزيم محبوس شده در ژل در استفاده هاي مكرر در زمانهاي 0،28،96،144،195 ساعت انجام شد .در مرحله بعد جهت بدست آوردن Km و Vmax سويستراي فنلي در مورد آنزيم تثبيت شده در محيط استونيتريل با درصدهاي 50،75 ،غلظتهاي مختلف از سويسترا از 5 - 10 * 3 تا M 4 - 10 * 2 مورد آزمايش قرار گرفت و Km و Vmax از روش لاين ويور برك بدست آمد .در نهايت سنجش ميزان توليد ال -دوپا توسط آنزيم تثبيت شده و در محيط 75/. استونيتريل مورد مطالعه قرار گرفت .لازم به ذكر است كه هر آزمايش حداقل سه بار تكرار شده است .نتيجه آنكه محيط حاوي 75/. استونيتريل و 25/. بافر فسفات توانست درحفظ فعاليت كرزولار آنزيم بسيار موثر باشد به نوعي كه افت فعاليت پس از 4 بار استفاده مجدد به فواصل 48 ساعت 14/. بوده است .همچنين با محاسبه پارامترهاي سينتيكي مشاهده شد كه سرعت انجام واكنش با آنزيم محلول تفاوتي ندارد ولي ميزان تمايل آنزيم تثبيت شده كه در محيط حلالي فوق قرار گرفته است نسبت به سويسترا كاهش پيدا كرده است همچنين ميزان توليد ال- دوپا از آنزيم تثبيت شده در اين تحقيق µmol/min 4 / 21 مي باشد .